Синтез молочного жира осуществляется в две стадии: образование жирных кислот и глицерина, и синтез триацилглицеринов.

      В молочную железу в составе липидов крови поступает около половины всех жирных кислот,  участвующих в синтезе молочного жира.  Причем, из липидов крови образуются главным образом высокомолекулярные жирные кислоты (от С₁₈ и выше, частично С₁₆). Другая часть жирных кислот (от С₄ до С₁₄, частично С₁₆) синтезируется в тканях молочной железы из низкомолекулярных предшественников: летучих жирных кислот (в основном – 92-95% из уксусной и частично из масляной).

      Высокомолекулярные жирные кислоты, образовавшиеся при гидролизе триацилглицеринов крови, поглощаются железой, а затем подвергаются превращениям в самой железе. Так, например, установлено, что молочная железа больше поглощает стеариновой кислоты (С_18:0), чем олеиновой (С_18:1) в 3-4 раза, однако молочный жир содержит больше олеиновой кислоты. Объясняется это превращениями насыщенных кислот: стеариновой – в олеиновую, а пальмитиновой (С_16:0) – пальмитолеиновую (С_16:1) под действием специфической оксигеназы, в присутствии кислорода, при участии кофермента НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат – кофермент оксигеназ, катализирующих реакции дегидрирования, переносчик атомов водорода).

      Глицерин, входящий в структуру жира (триацилглицеринов), поступает в молочную железу в составе липидов крови, или синтезируется из ряда органических веществ, в том числе аминокислот, и главным образом, из продукта гидролиза глюкозы – диоксиацетонфосфата. Глицерин, а также и жирные кислоты, участвующие в синтезе молекул жира, предварительно должны быть активированы, без этого они не будут реагировать между собой. Активирование глицерина заключается в его фосфорилировании под действием фермента глицеролкиназы, при участии АТФ. Глицеролкиназа катализирует перенос фосфатных групп от АТФ к глицерину.