Производство осуществляется в два этапа. Основной причиной этого является то, что кефирные зерна являются объемистыми и сложными в обращении; легче контролировать относительно небольшие объемы материнской закваски.

На первом этапе в предварительно обработанную питательную среду вводят активизированные кефирные грибки.

Культивирование проводят при 23°С, причем доля вносимых грибков составляет приблизительно 5% (1 часть зерен на 20 частей питательной среды) или 3,5% (1 часть зерен на 30 частей молока). Продолжительность культивирования составляет приблизительно 20 часов; так как зерна имеют тенденцию опускаться на дно, рекомендуется промежуточное перемешивание в течение 10–15 минут каждые 2–5 часов. При достижении требуемого значения рН (скажем 4,5) закваску размешивают перед удалением зерен из материнской закваски, теперь также называемой фильтратом, путем процеживания. Сетка для процеживания имеет отверстия диаметром 3–4 мм. Грибки промывают в сетке для процеживания кипяченой и охлажденной водой (иногда обезжиренным молоком). Затем их можно использовать повторно для получения новой партии материнской закваски. Во время культивирования микробактериальная популяция вырастает примерно на 10% в неделю, так что зерна следует взвесить и удалить излишек перед повторным использованием партии. На втором этапе фильтрат можно охладить до температуры приблизительно 10°С, если его необходимо хранить перед использованием в течение нескольких часов. Или же, если будет произведено большое количество кефира, фильтрат можно сразу добавитьв предварительно обработанное молоко, предназначенное для использования в качестве питательной среды для производственной закваски. Дозировка составляет 3–5% от объема питательной среды. После культивирования при температуре 23°С в течение 20 часов производственная закваска готова к введению в молоко, подготовленное для производства кефира.